第51回米国血液学会総会 (51st ASH Annual Meeting)報告
- 白血病幹細胞研究の進捗に関して -

今回は、2009年12月5日から8日にかけて、米国ルイジアナ州 ニューオリンズで開催された第51回アメリカ血液学会総会から、白血病幹細胞に関連する最新のトピックスをご紹介します。

米国血液学会総会は、世界最大の血液学会で米国内外からの2万人以上の参加者、4千題を越える演題がありました。今回は、それら数多くの研究者の中より、John E. Dick博士が、学会を代表する賞であるE. Donnall Thomas Lecture and Prizeを受賞されました。

John E. Dick博士は、1994年に急性骨髄性白血病（AML）において、白血病を引き起こすLeukemia-initiating cellsの存在を報告しました¹⁾。以降、今日のがん幹細胞研究の先駆者として、その研究の進展に多大な貢献をされています。

本学会でも、白血病の薬剤耐性や再発などの病態において、白血病幹細胞（Leukemic stem cell: LSC）が関与する可能性は広く認識されていました。また、その治療戦略として白血病細胞の中に埋もれている微少なLSC自体を標的とした報告も複数ありました。

今回はScientific Programの“Leukemia Stem Cells: Definition and Clinical Relevance”のセッションより、白血病幹細胞研究におけるトピックスを紹介していきたいと思います。このセッションでは、John E. Dick博士を含め、研究をリードする3人の研究者により最近の研究動向が論じられていました。

① John E. Dick博士：「微少で未分化なAML幹細胞に関して」
ヒトAML細胞分画の移植実験をもとに、白血病幹細胞が正常造血幹細胞と同様に、未分化なCD34⁺CD38^-分画に存在していることを報告。

② Michael L Cleary博士：「高頻度に存在する分化段階の進んだAML幹細胞に関して」
MLL融合遺伝子を導入したマウスAMLモデルをもとに、造血幹細胞分画だけでなく、より分化の進んだGranulocyte-macrophage progenitor (GMP)下流の分画にも白血病幹細胞が存在し得ることを報告。

③ Craig T. Jordan博士：「白血病幹細胞自体を標的とした新しい治療戦略^2）に関して」
Parthenolideなど白血病幹細胞のNFκB signalを標的とした新しい治療戦略を報告。

図1に各演者が焦点を当てた細胞集団の概略を示します。

図1 AMLにおける白血病幹細胞

上記に示されるように、John E. Dick博士とMichael L. Cleary博士の報告は、相対する内容でした。この二人の研究成果は、白血病幹細胞の研究に重要な情報であると考えられましたので、両者のこれまでの研究報告を含めて紹介します。

John E. Dick博士は、白血病幹細胞の発見における過程や、近年議論の対象となっている白血病幹細胞の存在頻度や階層性に関しての講演をされていました。また、白血病幹細胞を標的とした治療戦略の開発にも積極的に取り組まれており、抗体療法（CD44⁴⁾、CD123⁵⁾）の可能性も提示されていました。以下に、Dick博士の講演内容を大きく3つの項目に分けて紹介します。

(1) CD34⁺CD38^-における白血病幹細胞の発見
(2) CD34⁺CD38^-以外の分画における白血病幹細胞の可能性
(3) 白血病幹細胞の評価に関して

(1) CD34⁺CD38^-における白血病幹細胞の発見
Dick博士らは、1994年¹⁾、1997年³⁾、SCIDおよびNOD/SCIDマウスへのヒト急性骨髄性白血病（AML）の移植実験によって、白血病を引き起こすSCID leukemia-initiating cells (SL-IC)が、ヒトAML末梢血単核球細胞のうち0.2〜100/10⁶個と、非常に低い頻度で存在することを報告しました。

Dick博士らは、このSL-ICが、未分化なヒト正常造血幹細胞と同様のCD34⁺CD38^-分画に濃縮され、より分化した細胞集団であるCD34⁺CD38⁺分画やCD34^-分画には存在しないことを示しました。これによりヒトAMLにおいて、CD34⁺CD38^-を頂点とした白血病幹細胞が存在することを初めて明らかにしました。さらに、この白血病幹細胞の自己複製能力が正常造血幹細胞より高いことや、個々の白血病幹細胞においてもその自己複製能に差があることなどを報告してきました

(2) CD34⁺CD38^-以外の分画における白血病幹細胞の可能性
今回の講演においてDick博士は、ヒトAMLのCD34⁺CD38⁺分画においても、SL-ICが存在する検体があったことを報告しています。彼らは、このCD38の発現に関して、正常造血幹細胞の側面からも詳細な解析を進めています。2006年の論文⁶⁾では、低頻度ではあるがCD34⁺CD38^lo分画にも、長期骨髄再構築能を持つ細胞が存在したことを報告しています。さらに2007年には、正常造血幹細胞におけるCD38^loの発現は可逆的であり、自己複製における細胞周期へのエントリーを反映していることを報告しました^７）。これらCD38の発現が、白血病幹細胞においても同様の意味を持つかに関しては、今後の検証が期待されました。

その他、Dick博士らは、ヒトの造血幹細胞としての活性が、Lin^-CD34^-分画においても非常に低頻度ですが認められたことを以前に報告しています⁸⁾。本学会においても、intra-bone marrow injection (IBMI)を用いた免疫不全マウスへの移植実験において、ヒト臍帯血中のLin^-CD34^-分画からの長期骨髄再構築^(No.815)が報告されました。これらヒトのLin^-CD34^-の分画に、より未分化な造血幹細胞、あるいは、白血病幹細胞が存在する可能性も、今後の解明が待たれる領域と考えられました。

(3) 白血病幹細胞の評価に関して
近年、MLL-AF9などマウス白血病モデルにおいて、白血病幹細胞は必ずしも低頻度や未分化である必要はないとする報告がされています。Dick博士は、2008年のASH 50th anniversary review^9）において、造血幹細胞のpre-leukemicな変異に加え、前駆細胞段階での変異が白血病の発症を引き起こす可能性、また、前駆細胞が何らかの変異によって自己複製能を獲得する可能性はあることを解説しています。ただし、レトロウイルスによる遺伝子導入を用いマウス白血病モデルは、過剰な導入遺伝子発現による非生理学的な影響の可能性があること、また、実際のヒト白血病における病態との詳細な相関解析が必要であることを指摘していました。

このように白血病幹細胞の存在頻度について明確な結論がでた訳ではありませんが、Dick博士は、自己複製能と分化能が白血病幹細胞の定義において、より重要であると指摘しています。すでに彼らは、レンチウイルスによるマーキングよって、幹細胞の動きをSingle cellレベルで追跡できる移植実験系¹⁰⁾を構築しています。これまでの検証により、CD34⁺CD38^-の正常造血幹細胞と同様にAML白血病幹細胞おいても、その自己複製能の違いにより、Short-term、Long-term、また、静止期にあるQuiescent long-termの幹細胞が存在していることを報告しています。これはAMLにおける白血病幹細胞が、個々の幹細胞レベルでは機能的にヘテロであったことを証明しており、今後の治療戦略を考える上でも新しい視点を提供すると考えられました。

Michael L. Cleary博士らのグループは、MLL融合遺伝子を導入したマウス白血病モデルから、白血病におけるがん化のメカニズムを詳細に解析しています。彼らは、AMLにおける白血病幹細胞が必ずしも未分化な造血幹細胞分画だけでなく、分化段階に入った細胞にも存在し得ることを報告しました。以下に、Cleary博士の講演内容を大きく2つの項目に分けて紹介します。

(1) MLL-AF9マウス白血病モデルにおける高頻度の白血病幹細胞の存在
(2) MLL融合遺伝子による白血病幹細胞のES細胞様自己複製能の獲得

(1) MLL-AF9マウス白血病モデルにおける高頻度の白血病幹細胞の存在
Cleary博士らのグループは、MLL-AF9をマウス造血幹細胞および前駆細胞を含むc-kit⁺分画に導入することで、ヒトAMLのM4、M5相当のマウス白血病モデルを作成しました。彼らはこのモデルにおいて、先のKrivtsovらの報告にあるLineage^-のGMP-like leukemic cell¹²⁾よりも、さらに分化の進んだLineage⁺のGMP末端領域から、自己複製能と階層性を有する白血病幹細胞が誘導されたことを報告^11）しました。

また、AML発症マウスの骨髄細胞または脾臓細胞のコロニーアッセイにおいて、その25%〜30%の細胞がコロニー形成能を持つことを確認しました。さらに、形成された各コロニーから10⁶個の細胞を放射線照射マウスへ移植することにより、移植した全てのマウスでAMLが発症したことや、同様のコロニー形成を介した2次移植、3次移植が可能であったことも証明しました。彼らは、これらの結果より、マウスMLL-AF9白血病モデルにおいて、その1/4の細胞に白血病幹細胞として白血病発症能が存在したことを報告しました。

さらに彼らは、同じ細胞を用いたLimiting dilution/Poisson curveによる移植実験において、算出される白血病幹細胞の頻度が1/121へと低下することを確認しました。これにより、たとえ同種間の移植実験であっても、白血病幹細胞の生着効率が、その存在頻度の算出に影響することが考えられました。よって、Cleary博士は、これまでに異種間移植において、1/10⁴〜1/10⁷と報告されたヒトAML幹細胞の存在頻度は、マウス生体環境におけるホーミング能力の差によって、実際の割合より低く見積もっている可能性があることを指摘していました。

また、MLL-AF9によって誘導された白血病幹細胞は必ずしも静止期(G₀期)ではなく、その大部分は代謝活性が高いことも確認されました。特に白血病幹細胞の存在頻度が高い未分化な細胞(c-kit⁺)の方が、分化段階にある細胞（c-kit^-）より多く細胞周期に入っていることが確認されており、この点に関しても、これまでのQuiescentな白血病幹細胞の概念とは相反する報告となっています。

(2) MLL融合遺伝子による白血病幹細胞のES細胞様自己複製能の獲得
Cleary博士らは、MLL-AF9 AMLモデルマウスにおける自己複製能の獲得は、当初造血幹細胞と同様にHox関連の遺伝子が活性化されると報告されました^11）。その後、より直接的な要因として、Meis1の発現亢進によるBmi-1の発現上昇とそれに伴うInk4aの転写抑制が、白血病幹細胞の維持に重要であることを報告しました¹³⁾。さらに2009年には、Hoxa/Meisに非依存的な自己複製能の獲得には、ES細胞様の維持機構としてMyb, Hmgb3, Cbx5が使用されていることを報告しました¹⁴⁾。これは、従来考えられた体細胞様の自己複製能だけでなく、場合によってはES細胞様の自己複製能が獲得される可能性を新たに示す報告となりました。

これら、レトロウイルスによる遺伝子導入によって誘導されたマウス白血病モデルにおいては、Dick博士の指摘するように、実際のヒト白血病との相関解析が必要であると考えられています。しかし、Cleary博士らの報告には、本来、自己複製能を持たないGMP下流分画における高頻度の白血病幹細胞の存在や、ES細胞様の転写因子の獲得など、これまでにない報告が盛り込まれており、今後の白血病治療における新しい標的の可能性としても期待されるものでした。

John E. Dick博士らのグループは、正常造血幹細胞に関してもこれまで多くの研究成果を発表しています。今回ASHの演題^（No.816）において、NOD/SCID/IL-2rg^null miceへ臍帯血由来の1個の Lin^-CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-Rho^loCD49f^hi細胞を移植し、18週後の解析においてヒトのさまざまな造血・免疫細胞の再構築が可能であったことを報告していました。マウスにおいては、1996年に1個の造血幹細胞からの造血系再構築の報告が行われましたが、ヒト造血幹細胞においては初めての報告であり、ヒト造血幹細胞の解明をSingle cellレベルへと進めた新たな一歩を示す業績と考えられました。

これらDick博士の研究過程は、先にBloodに掲載されたASH 50^th anniversary review⁹⁾において述べられています。当時、免疫不全マウスとFluorescence activated cell sorter (FACS™)の2つのテクノロジーを組み合わせることができたことは、Dick博士の進めてきた、正常造血幹細胞の研究から白血病幹細胞の存在を解き明かす実験のアプローチにおいて、非常に重要であったことが記述されています。その中で、今日のがん幹細胞研究の始まりとなった1994年¹⁾のAMLの論文において、Dick博士とポスドクのLapidotが、当時最新のセルソーターであったFACStar™を借り受けるため、TorontoよりNew YorkのRoswell Park研究所に向かい、一日中ソートした細胞を大急ぎでTorontoに細胞を持ち帰り、免疫不全マウスに移植していたことが述懐されていました。

以上、これら様々な視点からの新しい発見が、白血病の発生機序におけるより深い理解の基礎となり、新しいがんの治療戦略の立案につながることが大いに期待されると考えられました。私達も、AMLにおける幹細胞研究に携わる機会^15,16,17)に恵まれましたが、フローサイトメトリーを活用した新しいアプリケーションが幅広い幹細胞研究に役立てられるよう、さらなる努力を積み重ねるとともに、基礎研究から医療や創薬への還元を見据えた研究まで支援することができればと考えております。

1) Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres-Cortes J, Minden M, Paterson B, Caligiuri MA, Dick JE.　A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.　Nature. 1994 Feb 17;367(6464):645-8.

2) Guzman ML, Rossi RM, Karnischky L, Li X, Peterson DR, Howard DS, Jordan CT.　The sesquiterpenelactoneparthenolide induces apoptosis of human acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells.　Blood. 2005 Jun 1;105(11):4163-9. Epub 2005 Feb 1.

3) Bonnet D, Dick JE.　Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.　Nat Med. 1997 Jul;3(7):730-7.

4) Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE.Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 2006 Oct;12(10):1167-74. Epub 2006 Sep 24.

5) Jin L, Lee EM, Ramshaw HS, Busfield SJ, Peoppl AG, Wilkinson L, Guthridge MA, Thomas D, Barry EF, Boyd A, Gearing DP, Vairo G, Lopez AF, Dick JE, Lock RB.　Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells.　Cell Stem Cell. 2009 Jul 2;5(1):31-42.

6) McKenzie JL, Gan OI, Doedens M, Wang JC, Dick JE.　Individual stem cells with highly variable proliferation and self-renewal properties comprise the human hematopoietic stem cell compartment.　Nat Immunol. 2006 Nov;7(11):1225-33. Epub 2006 Oct 1.

7) McKenzie JL, Gan OI, Doedens M, Dick JE. Reversible cell surface expression of CD38 on CD34-positive human hematopoietic repopulating cells. Exp Hematol. 2007 Sep;35(9):1429-36. Epub 2007 Jul 25.

8) Bhatia M, Bonnet D, Murdoch B, Gan OI, Dick JE.　A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity.　Nat Med. 1998 Sep;4(9):1038-45.

9) Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research. Blood. 2008 Dec 15;112(13):4793-807.

10) Guenechea G, Gan OI, Dorrell C, Dick JE. Distinct classes of human stem cells that differ in proliferative and self-renewal potential. Nat Immunol. 2001 Jan;2(1):75-82.

11) Somervaille TC, Cleary ML. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 2006 Oct;10(4):257-68.

12) Krivtsov AV, Twomey D, Feng Z, Stubbs MC, Wang Y, Faber J, Levine JE, Wang J, Hahn WC, Gilliland DG, Golub TR, Armstrong SA.　Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.　Nature. 2006 Aug 17;442(7104):818-22. Epub 2006 Jul 16.

13) Wong P, Iwasaki M, Somervaille TC, So CW, Cleary ML. Meis1 is an essential and rate-limiting regulator of MLL leukemia stem cell potential. Genes Dev. 2007 Nov 1;21(21):2762-74. Epub 2007 Oct 17.

14) Somervaille TC, Matheny CJ, Spencer GJ, Iwasaki M, Rinn JL, Witten DM, Chang HY, Shurtleff SA, Downing JR, Cleary ML. Hierarchical maintenance of MLL myeloid leukemia stem cells employs a transcriptional program shared with embryonic rather than adult stem cells. Cell Stem Cell. 2009 Feb 6;4(2):129-40.

15) Ishikawa F, Yoshida S, Saito Y, Hijikata A, Kitamura H, Tanaka S, Nakamura R, Tanaka T, Tomiyama H, Saito N, Fukata M, Miyamoto T, Lyons B, Ohshima K, Uchida N, Taniguchi S, Ohara O, Akashi K, Harada M, Shultz LD. Chemotherapy-resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region. Nat Biotechnol. 2007 Nov;25(11):1315-21. Epub 2007 Oct 21.

16) Saito Y, Uchida N, Tanaka S, Suzuki N, Tomizawa-Murasawa M, Sone A, Najima Y, Takagi S, Aoki Y, Wake A, Taniguchi S, Shultz LD, Ishikawa F. Induction of cell cycle entry eliminates human leukemia stem cells in a mouse model of AML. Nature Biotechnol. Epub 2010 Feb 14

17) Saito Y, Kitamura H, Hijikata A, Tomizawa-Murasawa M, Tanaka S, Takagi S, Uchida N, Suzuki N, Sone A, Najima Y, Ozawa H, Wakw A, Taniguchi S, Shultz LD, Ohara O, Ishikawa F. Identification of Therapeutic Targets for Quiescent, Chemotherapy-Resistant Human Leukemia Stem cells. Science Translational Medicine, 2010 Feb 3, Vol2, Issue17.

1. 51th ASH オンラインプログラム＆アブストラクト
http://ash.confex.com/ash/2009/webprogram/start.html

2. BD™ Phosflow technology
John E.Dick博士らは、2009年の論文において、anti-CD123抗体による白血病幹細胞へのIL-3シグナル伝達の遮断を、BD™ Phosflow　(pStat-5抗体)を用いて証明しています。BD™ Phosflowは、従来のウエスタン・ブロット法では不可能であった、個々の細胞におけるリン酸化シグナルの解析を可能としました。
http://www.bdbiosciences.com/research/phosflow/features/rapidanalysis.jsp

3. Multicolor Flow Cytometry Welcome to a More Colorful World^SM
マルチカラー解析は幹細胞研究においても非常に重要なツールとなっています。現在、より安定なタンデム色素であるAPC-H7、Violetレーザーで励起できるV450やV500など、新しい蛍光色素標識抗体が続々とリリースされています。
http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/index.jsp

4. Stem Cell Research
セルソーターは幹細胞研究において必要不可欠な装置となっています。BD FACSAria™シリーズは、光学検出部位にフローセルを搭載することで、従来のセルソーターにはない高感度の解析と高速ソーティングを両立しています。
http://www.bdbiosciences.com/research/stemcell/index.jsp