フローサイトメーターによる細胞の生死判定

正確に細菌の生細胞数、死細胞数、全細胞数を測定することは、多くの微生物学研究にとって重要です。もともと細菌の生死判定は、固形培地でのコロニー形成能力および液体ブイヨン中の増殖能力をみることにより実施されてきました。

この培養をベースとする細胞の生死判定は長時間を要し、成長の遅いまたは生存できるが培養できない細胞類については、適切な方法ではありません。また、リアルタイムの判定結果もしくは、タイムリーな情報が必要な生産の現場等においては従来法は適していません。
BD Biosicences Immunovytometry では、従来法の問題点を解決可能な BD Cell Viability Kit および BD Cell Viability Kit with BD Liquid Counting Beads を用いたフローサイトメトリーによる細胞の生死判定法をご提案いたします。

● 用途例

• 細菌/微生物の生死細胞数の迅速測定^1-4
  
• 細菌/微生物に対する殺菌剤の効果判定⁵
  
• 発酵中の酵母の生死判定⁶
  
• 培養液中の細胞の生死判定および濃度測定
  
• フローサイトメーター測定前の細胞の生死判定および濃度測定
  
• 研究用の精子生死判定^7,8
  
• デブリスを含む細胞調製液中の細胞の生死判定
  

●　製品の測定原理

フローサイトメーターで真核細胞と原核細胞の細胞懸濁液中の生存細胞数を迅速かつ正確に測定できます。^1-3,7,8

このキットには、フローサイトメーターで生死細胞を簡単に識別できる TO ( thiazole orange ) , PI ( propidium iodide ) の2種類の色素が含まれています。2種類の色素の TO は全ての細胞を染色するために用い、一方の PI は死細胞のみを染色するために用います。

生細胞は細胞膜に損傷受けていないので PI のような色素は、細胞内に透過しませんが、細胞膜に損傷を受けている細胞は、PI が細胞内へ透過します。 TOは透過性を持つ色素で、全ての細胞（生細胞/死細胞）へ浸透し、生細胞と死細胞を異なる度合いに染色します。

この2種類の色素によって末梢血単核細胞、哺乳類細胞株、細菌および酵母などの真核細胞と原核細胞の生死を迅速かつ正確に選別することが可能になります。

キットにはBD Liquid Counting Beadsつきとなしの2種類があり、このビーズは、蛍光ビーズの懸濁液としてKitに同梱されています。このビーズは、細胞の絶対数を測定するためにサンプルに添加します。

●　製品の概要

NAME	COMPONENT	SIZE	CAT.NO.	希望小売価格
BD Cell Viability Kit	ＴO ： thiazole orange　･･･ 1vial （42μM /500μL in DMSO） PI ： propidium iodide　･･･ 1vial （4.3mM/500uL in water）	100 tests	349483	\33,000
BD Cell Viability Kit with BD Liquid Counting Beads	ＴO ： thiazole orange ･･･ 1vial （42μM /500μL in DMSO） PI ： propidium iodide ･･･ 1vial （4.3mM/500uL in water） BD Liquid Counting Beads ･･･ 1vial （10mL in buffer with 0.1% NaN3 ）	100 tests	349480	\68,000

●　検体の前処理

培養細胞または末梢血単核球の場合は測定検体を 5X10⁵ - 10⁷ cells/mL の範囲に入るように推奨 staining buffer^＊で10倍以上希釈し、調製して下さい。

また、医薬品、食品、環境サンプルなどのような特殊な検体をフローサイトメーターで検出する場合は最低でも 100 oraganisms/mL 以上であることが必要です。 ＊ 推奨 staining buffer

• 0.2%　Puluoric^(R)F-68^＊　含有 生理リン酸緩衝バッファー（Physiologic PBS）
• 1mM EDTA

細菌測定の場合は、Puluoric^(R)の代わりにTween-20を使用することも可能です。調製後、0.22μmフィルターでろ過して下さい。
＊　Puluoric^(R)F-68 はBASF社の製品です。

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●　染色

細菌／酵母

• 細胞懸濁液 500 μL に TO , PI を各 5.0 μL を添加、ボルテックス混和後、
• 室温で 5 分間インキュベートする。
• 最終染色濃度：　TO　420nM　,　PI　43μM

哺乳類細胞

• 細胞懸濁液 2.0 mL に TO 4.0 μL , PI 2.0 μL を添加、ボルテックス混和後、
• 室温で 5分間インキュベートする。
• 最終染色濃度：　TO　105 nM　,　PI　11 μM

ウシ精液

• 細胞懸濁液 2.0 mL に TO , PI を各 2.0 μL を を添加、ボルテックス混和後、
• 室温で 5分間インキュベートする。
• 最終染色濃度：　 TO　53 nM　,　PI　11μM　・　

備　考　：　BD Liquid Counting Beadsを使用する場合
あらかじめビーズを室温に戻してから使用して下さい。フローサイトメトリー解析を行う前に、ビーズを 30 秒間穏やかにボルテックス混和 し、各検体チューブに正確に 50 μL 添加します。検体チューブをキャップし、穏やかに ボルテックス混和して下さい。

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●　フローサイトメトリー解析

488nm で励起可能なフローサイトメーターを用いて解析して下さい。

・フローサイトメーター機器設定
BD CaliBRITE^TM 3 beads(CAT.NO.349502) と BD FACS Comp^TMまたはBD AutoComp^TM を用いて PMT Voltages 調整、蛍光 Compensation 調整、使用する前の機器感度チェックを行って下さい。

• 哺乳類サンプルを使用する場合、thresholdは FSC で設定し､ BD Liquid Counting Beads を併用するときには、threshold は FL1 で設定します。
• 微生物サンプルを使用する場合、 threshold は SSC で設定します。
• 細胞集団のゲートは、 SSC vs FL2 を使用し、生死細胞の識別は、 FL1 vs FL3 を使用して下さい。

・測定結果の解析
細胞集団の濃度を求める際には以下の方程式を使用して下さい。



* bead/test の値は BD Liquid Counting Beads のロットごとに異なります。

●　解析（例 1）　：　E coli

• 検体　：　E.colib　500μL
• 染色　：　TO 5μL　/　PI 5μL
• Liquid Counting Beads　：　50 μL 添加

TO,PIの染色度合いにより生菌、損傷した細菌、死菌をそれぞれ R4 , R5 , R6としてゲーティングした図です。
（ FSC vs SSC で E.coli を R1、BD Liquid Counting Beads を R2 、さらに FL2 vs SSC で E.coli を R3 region 設定し、( R1 or R2 ) and R3 のゲート内細胞を FL1vs FL3 で解析しています。）

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●　解析（例　2）　：　末梢血単核球　（PBMCs）

• 検体　：　末梢血単核球（PBMSc）　2mL
• 染色　：　TO 4μL / PI 2μL
• Liquid Counting Beads　：　50μL添加

TO , PI の染色度合いにより死細胞、BD Liquid Counting Beads 、生細胞をそれぞれ R3 , R4 , R5 としてゲーティングした図です。

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●　解析（例　3）　：　Raji 細胞　（セルライン）

• 検体　：　Raji 細胞 2mL
• 染色　：　TO 4 μL　/　PI 2 μL
• Liquid Counting Beads　：　50 μL　添加

TO , PI の染色度合いにより死細胞、 BD Liquid Counting Beads 、生細胞をそれぞれ R3 , R4 , R5 としてゲーティングした図です。

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●　解析（例　4）　：　ウシ精液　（精子細胞）

• 検体　：　凍結融解したウシ精液 20 μL をstainning buffer で 2 mL に調製
• 染色　：　TO 2 μL　/　PI 2 μL

TO , PI の染色度合いにより死細胞、生細胞をそれぞれ R2 , R3 としてゲーティングした図です。

1. Nebe-von-Caron G, Stephens PJ, Badley AR. Bacterial detection and differentiation by cytometry and　fluorescent probes. Proc Royal Microbiol Society. 1999;34:321-327.
2. Nebe-von-Caron G, Stephens PJ, Hewitt Cj, Powell JR, Badley RA. Analysis of bacterial function by multi-colour fluorescence flow cytometry and single cell sorting. J Microbiol Meth. 2000;42:97-114.
3. Davey HM, Kell DB. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses. Microbiol Rev. 1996;60:641-696.
4. Alsharif R, Godfrey W. Bacterial detection and live/dead discrimination by flow cytometry. Microbial Cytometry Application Note.BD Biosciences, Immunocytometry Systems; San Jose, CA. 2002.
5. Alsharif R, Tapia M, Godfrey W, Wanalund J, Nagar M. Bacterial disinfectant efficacy using flow cytometry. Microbial Cytometry Application Note.BD Biosciences, Immunocytometry Systems; San Jose, CA. 2002..
6. Thornton R, Godfrey W, Gilmour L, Alsharif R. Evaluation of yeast viability and concentration during wine fermentation using flow cytometry. Microbial Cytometry Application Note.BD Biosciences, Immunocytometry Systems; San Jose, CA. 2002.
7. Graham JK. Assessment of sperm quality: a flow cytometric approach. Anim Reprod Sci.2001;68:239-247.
8. Yamamoto T, Mori S, Yoneyama M, Imanishi M, Takeuchi M. Evaluation of rat sperm by flow cytometry: simultaneous analysis of sperm count and sperm viability.J Toxicol Sci. 1998;23:373-378