BD Stem Cell Enumeration Kit システム

BD バイオサイエンスは、ISHAGE（国際血液療法・移植学会、The International Society of Hematotherapy and Graft Engineering）によるCD34陽性細胞絶対数測定に関するガイドラインが提唱される前に、フローサイトメーターの臨床アプリケーションとして、世界で初めて、独自にCD34陽性造血前駆細胞の絶対数測定システムProCOUNTを開発し、長年に渡りGolden Standard として提供しています。
このProCOUNT Kit のノウハウを引き継ぎ、より最近のニーズに合った、サンプル中の死細胞を解析から除外するための試薬、7AADを組み込んだ試薬システムをキット化しました。
※キット品ではなく、単品製品による使用システムについては、造血幹細胞数測定システムをご参照ください。　

• ISHAGEガイドラインに準拠したプロトコール
  国際血液療法・移植学会（The International Society of Hematotherapy and Graft Engineering；ISHAGE）は1996年、末梢血およびアフェレ−シス産物中のCD34陽性細胞のフロ−サイトメ−ターによる迅速かつ高感度な方法を評価するためにStem Cell Enumeration Committeeを編成し、同年ガイドラインを作成しました。BD SCE Kit は次のガイドライン項目について準拠しています。
• CD34 モノクローナル抗体：　Class II またはIIIのクローンを使用
  --- CD34 PE のクローン, 8G12h はクラスIIIのクローンです。
• 非特異染色細胞を解析から除外するために、CD45を同時に染色する。
  --- CD45 FITC/CD34 PE のカクテル試薬、CD45 bright+ CD34+ 細胞を解析から除外し、CD45 dim のみのCD34+ 細胞を検出します。
• 死細胞による非特異染色細胞を解析から除外するために、7-AAD などの核染色剤で死細胞を確認し、解析時に除外する。
  --- 予め濃度調整された7AAD試薬を添加し、死細胞を検出します。
• 内部標準ビーズ同時測定による絶対数の算定
  （従来のCD34陽性細胞比率に血球カウンターによる白血球数を乗じて算出するデュアルプラットフォームから、シングルプラットフォームへの推奨）
  --- TruCOUNTチューブによる絶対数測定システム
  ※フローサイトメーター測定用チューブに予め既知数の蛍光ビーズが凍結乾燥ペレットの形状でセットされています。検体を正確に添加し、試薬および赤血球溶血剤を加え反応させます。そのまま洗浄せずに、均一になるように攪拌し、フローサイトメーターにセットし測定します。CD34陽性細胞カウント数とTruCOUNTビーズのカウント数により、絶対数を算出します。
  
  絶対数換算式：
  CD34陽性細胞絶対数 cells/μL＝
  　CD34陽性細胞カウント数　　ｘ　　TruCOUNTチューブ内全ビーズ数　
  TruCOUNTビーズカウント数　　　　　　　　検体量（100μL）

BD Stem Cell Enumeration Kit 　50テスト用
カタログ番号：344563
希望小売価格：89,000円
＜キット構成品＞
・BD Stem Cell reagent（CD45/CD34）
　CD45 FITC（クローン; 2D1）
　CD34 PE（クローン; 8G12）
・7- aminoactinomycin-D（7-AAD）試薬
・10 x 塩化アンモニウム溶血剤
・BD Trucount チューブ　50本

BD™ Stem Cell Enumeration Template for BD CellQuest™ and BD CellQuest Pro Software（CD-ROM）
カタログ番号：648089
※BD FACSCalibur フローサイトメーターをご使用の場合は、データ取り込み・解析テンプレートを無償でご提供します。

BD™ Stem Cell Enumeration Application Module for BD FACSCanto™ Clinical Software（CD-ROM）
カタログ番号：650148
※BD FACSCantoII フローサイトメーターをご使用の場合は、自動データ取り込み・解析、ソフトウェアBD FACSCanto Clinical Software の無償アップグレードをご提供します。

• BD TruCOUNTチューブを用意し、検体名、検体番号などをラベルします。
• BD Stem Cell Reagent 20μL,および7AAD試薬20μＬを BD TruCOUNTチューブのビーズペレットに触れないように、リテイナー上部の位置に添加します。
• 検体100μＬを精度調整されたピペットを用い、正確に加え、穏やかにvortexで攪拌します。
  ※リバース式ピペッティングを推奨しています。
• 室温、暗所で20分間インキュベーションします。
• 10ｘ塩化アンモニウムを精製水で10倍希釈したものを、2 mL加え、穏やかにvortexで攪拌します。
• 室温、暗所で10分間インキュベーションします。
• すぐにアイスバスに入れ、1時間以内に測定します。

◆ 3カラー測定用蛍光補正
FACSシリーズフローサイトメーターをご使用の場合

• BD FACSCalibur の場合は、FACSComp のアッセイモード Lyse No/Wash によるCompensation 値を使用
• BD FACSCanto の場合は、Canto Clinical Software のsetup Lyse/No Wash によるCompensation 値を使用

その他フローサイトメーターをご使用の場合

• CD4など、汎用されているFITC、PE標識抗体による単染色サンプルと7AAD染色サンプルを用いて、マニュアルあるいは自動計算プログラムにより蛍光補正値を設定。

◆ Threshold の設定
CD45 FITC パラメーターにThresholdを設定します。
通常、Threshold はFSC(前方散乱光)に設定しますが、CD45FITC/SSCプロットを作成し、サンプルを流しながら、赤血球溶血後、洗浄しないために大量に混在しているデブリ（CD45陰性）をCD45 FITCパラメーターによるThresholdで削除します。その際、CD45が弱く染色しているCD34陽性細胞が削除されないように注意して設定します。

◆ 取り込み最終イベント数の設定：
CD45陽性白血球75000イベント　あるいは　CD34陽性細胞カウントが100になるまで取り込みます。

◆ CD34陽性細胞カウントのためのゲーティングストラテジー
(1) CD34 PE / SSC プロットで CD34陽性細胞をゲーティング
(2) CD34+CD45+brightの非特異染色細胞、CD34+7AAD+の死細胞による非特異染色細胞を、(1)のCD34陽性細胞のゲートから削除します。　
(3) さらに散乱光プロットFSC/SSCで、赤血球デブリの位置にあるCD34+細胞を削除します。